Desarrollo de una metodología para la transformación genética de banano (cv Gran Enano) y plátano (cv Curraré) de consumo local para introducir resistencia a la Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis)

Abstract

Los bananos y plátanos (Musa spp), ocupan el cuarto lugar en Producción a nivel mundial, lo que lo convierte en uno de los cultivos más importantes para los países en desarrollo. Sin embargo estos cultivos son seriamente amenazados por muchos problemas fitosanitarios, donde la Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis Morelet) es el principal problema, causando pérdidas entre un 30 y 50 por ciento. A nivel mundial el mejoramiento genético convencional se ha visto limitado debido a que son especies que presentan esterilidad, poliploidía y se propagan vegetativamente. La biotecnología ofrece las herramientas necesarias para superar esas barreras biológicas; una de esas herramientas es la transformación genética de cultivos celulares embriogénicos mediante el bombardeo de partículas cubiertas de ADN. Con este trabajo se logró establecer la calidad de las suspensiones celulares midiendo la capacidad de crecimiento en un período de 8 días, observaciones al microscopio y análisis histológico, evidenciaron una mejor calidad para el cultivar Curraré. Para establecer las condiciones de bombardeo se evaluó dos vectores de transformación genética, el pBI121 que expresa el gen reportero GUS y el gen marcador nptII con resistencia a kanamicina, el segundo plásmido que se probó fue el pHAGG, que presenta en su construcción el gen reportero GUS, el gen marcador hph, que le confiere resistencia al antibiótico higromicina y además presenta los genes de glucanasas y quitinasas de interés agronómico que degradan las paredes del hongo constituido principalmente por quitinas y glucanos. Ambos vectores de transformación se encuentran bajo el dominio del promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). La expresión transitoria se evaluó por medio del conteo de puntos azules 24 horas después del bombardeo; se evidenció mejores resultados para el cultivar Curraré a una distancia de 6 cm y con el microproyectil tungsteno, logrando obtener en promedio 2207 puntos azules para el mejor tratamiento. El material se sometió a selección con el medio de regeneración M3. Para cultivos celulares bombardeados con el vector pBI121 se utilizó el antibiótico kanamicina a una concentración de 100 mg/l y para el vector pHAGG el antibiótico a una concentración de 75 mg/l, después de 2 meses en selección. Se observó la regeneración de agregados celulares embriogénicos con formación de embriones en diferentes estados de desarrollo. En esta etapa se llevó a cabo un análisis histoquímico que reveló la presencia del gen GUS en los agregados celulares; el análisis histológico mostró la integración uniforme del agente revelador X-Gluc en el interior del tejido. Los embriones somáticos regenerados se subcultivaron al medio M4, logrando la germinación de 12 embriones. Secciones de tejidos de hoja y raíz se sometieron al agente revelador X-Gluc, observándose una tinción uniforme del tejido expuesto. Finalmente los embriones germinados fueron subcultivados a medio de desarrollo M5 con el agente selectivo a higromicina y después de 1 mes en este medio continúan en crecimiento, expresando la resistencia al antibiótico.