Liberación de protoplastos, reconstitución de la pared celular, proliferación del callo en tejidos de callo de Coffea arabica L.

Abstract

Uma metodologia para liberação e cultura de protoplastos de tecidos de café foi definida a fin de permitir a possibilidade de manipulação genética dentro do genero Coffea. Uma combinação de 2,5% Pectinase, 3,5 por cento, Driselase, 0,51 molal manitol e 6 IM CaCl, em pH 5,5 foi considerada ótima para liberação de protoplastos de células de calos de café após 7 horas de incubação a 50 rpm. A preparação de protoplastos foi pirificada por filtração através duas peneiras de aço inoxidável de 150 e 38 um. O filtrato foi coletado em tubos de centrifuga, centrifugado a 100 g por 3 min, o supernadante foi removido e o pellet de protoplastos foi resuspenso em 3 ml de meio de reseneração de parede. Esta rotina foi repetida tres vez para diluir os enzimas e eliminar or debris celulares. Finalmente, o pellet foi resuspenso em 1 - 2,5 ml de meio de regeneração de parede para atiingir uma densidade de 10°5 protoplas 105/ml. Suspensões de protoplastos de 0,5 ml foram cultivadas em placas de cultura contendo multipas divisões em condicões de luz difusa e alta humidade. Após 5 dias, o meio de regeneração de parede foi diluido com o meio de crescinento e a regeneração de parede celular em protoplastos foi observada com 0 uso de Calcoflror 0,1 por cento sob microscópio fluorescente. A regeneração de parede celular e a proliferação de calos foram observados em cerca de 30 por cento das culturas.