Crioconservación de embriones cigóticos y somáticos de cacao (Theobroma cacao L.)

Abstract

El presente trabajo de investigación se llevó a cabo en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales de la Unidad de Biotecnología del Programa de Agricultura Sostenible, Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza (CATIE), Turrialba, Costa Rica. La crioconservación de los embriones cigóticos inmaduros y de los embriones somáticos de cacao (Theobroma cacao L.) en nitrógeno líquido se realizó a través de congelamiento rápido y congelamiento lento. El congelamiento lento, en el cual fueron evaluadas tasas de congelamiento entre 0.4°C/min y 1.0°C/min, se llevó a cabo en un congelador programable en el cual se inició el proceso de congelamiento de 5°C hasta -40°C, seguido por el almacenamiento de los embriones en nitrógeno líquido, en donde permanecieron 48 horas. Para proteger los embriones contra el daño ocasionado por las ultrabajas temperaturas se estudió el efecto de una serie de factores físicos y químicos: Concentraciones de sacarosa en los medios de precultivo, niveles de prolina, efecto del ácido abscísico y deshidratación de los embriones en la cámara de transferencia. El descongelamiento de los embriones se realizó mediante la inmersión de las muestras en agua a 40°C por 90 segundos, y posteriormente se colocaron en el medio de recuperación. La respuesta de sobrevivencia de los embriones varió en dependencia del procedimiento de congelamiento utilizado. Sin embargo, las mayores tasas de recuperación se obtuvieron a través de la formación de callo. La mayor formación de callo se obtuvo con embriones cigóticos inmaduros incubados y precultivados en medios nutritivos con altas concentraciones de sacarosa en congelamiento rápido. La obtención de embriones somáticos a partir de los embriones cigóticos inmaduros congelados en nitrógeno líquido, únicamente fue posible cuando éstos fueron incubados en un MON líquido con 1.0M de sacarosa y congelados a una tasa de 0.5°C/min y cuando fueron incubados en un MON líquido con 0.5M de sacarosa y congelados por inmersión directa en nitrógeno líquido. La recuperación de los embriones somáticos congelados por inmersión directa en nitrógeno líquido y por congelamiento lento, a través de su germinación directa en el medio de recuperación, fue posible mediante la incubación de embriones somáticos de los genotipos EET-183 y POUND-12 en un medio MON líquido con altas concentraciones de sacarosa.